生物发光(bioluminescence, BL)是自然界中广泛存在的生物学现象，在物种进化历程中具有求偶、警示和辅助捕食等功能[1-4]，目前，在弧菌、水母、萤火虫及发光蘑菇等类群中均已观察到生物发光现象[5-9]。BL的本质为酶促反应释放可见光，不同BL系统在光谱、强度、细胞定位及能量依赖(如ATP与辅酶)上存在显著差异[10]。据保守估计，全球现存至少10 000种生物(以海洋类群为主)具有发光能力[11]，其中包含40余种不同的BL系统。然而，目前仅有7类荧光素和2种BL途径被深入解析[12]。图 1归纳了这7类荧光素分子的结构式，表 1系统总结了它们的来源物种、光谱特性及应用潜力。
图 1 七类荧光素分子的结构式[12]
Fig. 1 Molecular structures of seven luciferins[12].
图选项
表 1 七类荧光素的物种来源、光谱特性与应用比较
Table 1 Comparative analysis of taxonomic origins, spectral properties, and applications of seven luciferins
Luciferins
Spectrum
Primary source species
Advantages
Limitations
Firefly luciferin
552–620 nm yellow-green light
Coleoptera: Lampyridae (Photinus pyralis Linnaeus)
Superior luminous efficacy; extensive utility in biomedical imaging and reporter gene systems
ATP/Mg2+ cofactor dependency; limited chemical stability in physiological conditions; rapid metabolic clearance in vivo
Coelenterazine
460–480 nm blue light
Hydrozoa: Aequoreidae (Aequorea victoria Murbach & Shearer)
Low molecular weight; membrane permeability facilitates real-time intracellular tracing
Low photon flux density; high cost of chemical synthesis; strict storage conditions
Bacterial luciferin
485–500 nm blue-green light
γ-Proteobacteria: Vibrionaceae [Aliivibrio fischeri (Beijerinck) Urbanczyk et al.]
Low oxygen requirement; continuous monitoring of anaerobic metabolic processes
Low photon flux density; restricted to prokaryotic expression platforms
Fungal luciferin
515–535 nm green light
Basidiomycota: Mycenaceae [Mycena chlorophos (Berk. & M.A. Curtis) Sacc.]
Non-toxic precursor compounds; emerging applications in plant synthetic biology and bioengineering
Immature heterologous expression
Cypridina luciferin
450–470 nm deep blue light
Ostracoda: Cypridinidae [Vargula hilgendorfii F. Müller]
Millisecond-scale flash kinetics; metal ion sensitivity enables heavy metal biosensing
Poor stability; requires cryogenic storage; complex purification from marine arthropods
Krill luciferin
470–510 nm blue light
Euphausiacea: Euphausiidae (Euphausia superba Dana)
Cryophilic adaptation; novel probe for polar ecosystem dynamics
Limited commercial availability; ecologically constrained; nascent-stage application technology
Dinoflagellate luciferin
470–485 nm blue light
Dinophyceae: Noctilucaceae [Noctiluca scintillans (Macartney) Kofoid & Swezy]
Tool for dinoflagellate physiology and ocean ecology
Rapid oxidative degradation; nascent-stage application technology
表选项
尽管BL系统的物种来源多样，但截至目前，天然发光植物的相关报道比较有限。因此，科学家们希望创制出自然界中不存在的发光植物。1986年，Deluca团队[13]选用花椰菜花叶病毒35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter, CaMV 35S)，在烟草(Nicotiana tabacum L.)中过表达来源于北美萤火虫的荧光素酶基因；外源添加d-荧光素(d-luciferin)后，转基因烟草能够产生瞬时BL现象，但该荧光强度低，且空间分布异质性显著。2017年，Kwak等[14]采用硅纳米颗粒共载递送技术，将荧光素酶和d-荧光素同步导入豆瓣菜(Nasturtium officinale R. Br.)中。这降低了荧光素酶和d-荧光素对植物的毒性，使植株整体荧光强度提高至1.44×1012 photons/s，同时发光持续时间也延长到24 h以上。然而，该技术没有解决发光植物对外源底物的依赖，且制备工艺复杂、生产成本高昂。
为了实现植物“自主”发光，Krichevsky等[15]将鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi Boisvert et al.)用于发光的lux操纵子整合到烟草叶绿体基因组rps12/Trn和TrnI/TrnA的基因间隔区，成功构建了2个独立的转质体株系。该研究首次实现了植物内源性生物发光，为创制自发光植物提供了全新策略。图 2展示了5种典型发光细菌的lux操纵子结构，其核心基因簇为luxCDABEG[16]，该操纵子通过编码脂肪酸还原酶复合体(LuxCDE)和荧光素酶(LuxAB)，为植物自发光体系提供关键遗传元件。
图 2 五种典型发光细菌的lux操纵子结构[16]
Fig. 2 Structure of the lux operon in five canonical luminous bacteria[16]. luxA: Luciferase A subunit gene; luxB: Luciferase B subunit gene; luxC: Fatty acid reductase C subunit gene; luxD: Fatty acid reductase D subunit gene; luxE: Fatty acid reductase E subunit gene; luxF: Luciferase F subunit gene; luxG: Flavin reductase subunit gene; ribA: GTP cyclohydrolase Ⅱ subunit gene; ribB: 4, 4′-dihydroxy-benzophenone (DHBP) synthetase subunit gene; ribH: Lumazine synthetase subunit gene; ribE: Riboflavin synthetase subunit gene; luxR: Quorum sensing regulatory protein gene, transcribed in the opposite transcriptional orientation; luxl: Autoinducer synthase gene.
luxA：荧光素酶A亚基基因；luxB：荧光素酶B亚基基因；luxC：脂肪酸还原酶C亚基基因；luxD：脂肪酸还原酶D亚基基因；luxE：脂肪酸还原酶E亚基基因；luxF：荧光素酶F亚基基因；luxG：黄素还原酶亚基基因；ribA：GTP环巯基酶Ⅱ亚基基因；ribB：4, 4′-二羟基二苯甲酮(4, 4′-dihydroxy-benzophenone, DHBP)合成酶亚基基因；ribH：鲁马嗪合成酶亚基基因；ribE：核黄素合成酶亚基基因；luxR：群体感应调控蛋白基因(luxR基因的阅读方向与lux操纵子相反)；luxl：自诱导剂合成酶基因。 图选项
截至目前，机制被完全解析的BL途径仅有2种，分别是细菌发光途径和真菌生物发光途径(fungal bioluminescence pathway, FBP)。如图 3所示，细菌生物发光由lux操纵子编码的酶系协同完成，包括底物合成、荧光释放和辅因子循环这3个步骤[17]。其中，长链脂肪酸经LuxD、LuxE、LuxC催化转化为长链脂肪醛(细菌荧光素)[18]，随后异二聚体荧光素酶(LuxAB)在还原型黄素单核苷酸(reduced flavin mononucleotide, FMNH2)和O2的共同作用下，催化长链脂肪醛发生氧化，释放波长约490 nm的蓝绿色荧光[19]，同时产生的黄素单核苷酸(flavinmono nucleotide, FMN)由LuxG还原再生为FMNH2，从而完成辅酶的循环利用[19]。此外，部分细菌的lux操纵子还编码LuxF、LuxI和LuxR等蛋白：LuxF能与6-[3′-(R)-肉豆蔻酰基]-FMN特异性结合，促进反应正向进行[20]；LuxI负责合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone, AHLs)，该信号分子与转录因子LuxR结合后将激活lux表达，形成正反馈回路和群体感应调控网络(quorum sensing, QS)[21]。
图 3 细菌生物发光的分子机理
Fig. 3 Molecular mechanism of bacterial bioluminescence. The lux operon encodes a multi-enzyme system that synergistically catalyzes long-chain fatty acids to emit blue-green fluorescence (λ: ~490 nm). LuxA: Luciferase A subunit; LuxB: Luciferase B subunit; LuxC: Fatty acid reductase C subunit; LuxD: Thioesterase; LuxE: Fatty acid reductase E subunit; myrFMN: 6-(3′-(R)-myristoyl)-FMN; LuxF: myrFMN binding protein; LuxG: FMN reductase for cofactor recycling.
lux操纵子编码的蛋白酶系协同催化长链脂肪酸，释放波长约490 nm的蓝绿色荧光。LuxA：荧光素酶A亚基；LuxB：荧光素酶B亚基；LuxC：脂肪酸还原酶C亚基；LuxD：硫酯酶；LuxE：脂肪酸还原酶E亚基；myrFMN：6-[3′-(R)-肉豆蔻酰基]-FMN；LuxF：myrFMN结合蛋白；LuxG：FMN还原酶。 图选项
随着细菌BL分子机制的阐明，Hollis等[22]发现长链脂肪醛对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans Maupas)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen)等真核模式生物具有显著毒害作用。总之，细菌生物发光在植物中面临毒副作用大、转化效率低及同质化重组难度高等难题，但它在植物自发光上的突破为BL研究开辟了新的方向。与此同时，随着对其他BL途径的不断探索，越来越多研究者开始关注发光蘑菇中FBP的潜力。
1 FBP自发光植物的研究进展 目前，发光蘑菇作为除发光细菌外另一种重要的BL来源，已被广泛研究。截至2024年6月，全球共鉴定出122种发光蘑菇，它们主要分布在亚洲及美洲的热带、亚热带地区[23]。根据系统发育分析，目前已发现的发光真菌可划分为5个谱系：小菇属(Mycenoid，92种)、蜜环菌属(Armillaria，13种)、奥氏菇属(Omphalotus，14种)、光柄菇属(Lucentipes，2种)和曙杯菌属(Eoscyphella，1种)[24]。其中，除炭角菌[Xylaria hypoxylon (L.) Grev.]属于子囊菌门外，其余发光蘑菇均属于担子菌门(Basidiomycota)[25-26]。这一分类学特征为研究FBP分子机制和进化起源提供了重要线索(表 2归纳了9类重要发光蘑菇的NCBI分类号、地理分布和发光部位)。
表 2 九种重要发光蘑菇的NCBI分类号、地理分布与发光部位
Table 2 NCBI taxonomy, geographical distribution and glowing parts of nine key luminescent mushrooms
Fungi
NCBI ID
Distribution
Glowing part
References
Mycelium
Sporocarp
Cap
Stipe
Spores
Armillaria mellea
47 429
Europe, India, the USA
+
–
–
–
–
[23]
Desarmillaria tabescens
1 929 756
Europe, the USA
+
+
–
–
–
[23]
Neonothopanus nambi
71 958
Australasia, South America, China, Thailand
/
+
+
+
–
[23, 27-28]
Neonothopanus gardneri
1 069 186
South America
/
+
+
+
–
[23]
Mycena citricolor
2 018 698
South America, the USA
+
–
–
–
–
[23]
Mycena chlorophos
658 473
China, Japan, Sri Lanka
+
+
+
+
–
[23]
Roridomyces roridus
1 738 132
China, Europe, the USA, Japan, South America
+
–
–
–
–
[23, 29]
Omphalotus olearius
China, Europe
+
+
+
+
–
[23, 28]
Panellus stipticus
5 636
Africa, Japan, China, Europe, the USA, South America
+
+
+
–
–
[23]
+: Glow; –: Do not glow; /: No report or need identification.
表选项
1.1 FBP分子机制与进化起源的解析 1958年，Airth和McElroy首次从发光蘑菇蜜环菌[Amillaria mellea (Vahl) P. Kumm.]中分离出真菌荧光素和荧光素酶，并明确真菌生物发光需要还原性物质和分子氧的参与[30]。随后，Purtov等[31]综合利用高效反相液相色谱、核磁共振和高分辨率质谱等技术，进一步揭示了真菌荧光素及其前体物质的化学结构。2018年，Kotlobay等[32]成功解析了来自夜光小菇光茸菌[Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai] FBP的生物学机制，该途径由4个蛋白酶编码：牛奶树碱合酶(hispidin synthase, NnHispS)、牛奶树碱-3-羟化酶(hispidin-3-hydroxylase, NnH3H)、荧光素酶(luciferase, NnLuz)和咖啡酰丙酮酸水解酶(caffeylpyruvate hydrolase, NnCPH)。FBP的核心是咖啡酸循环：咖啡酸(caffeic acid, CA)在HispS的催化下生成牛奶树碱(hispidin)，随后牛奶树碱经H3H催化形成3-羟基牛奶树碱(真菌荧光素)；之后，3-羟基牛奶树碱在真菌荧光素酶Luz作用下被氧化，形成不稳定的高能中间体，该高能中间体分解时释放波长约520 nm的绿色荧光，并生成咖啡酰丙酮酸，最后咖啡酰丙酮酸被CPH回补为CA，从而实现咖啡酸循环，维持可持续的自发光。由于CA在真菌和植物中普遍存在，真菌可以利用自身或从植物中吸收的CA实现高亮度发光[1, 12]。
基于伞菌目(Agaricales)物种系统发育及HispS、H3H和Luz基因进化树的研究，发光蘑菇的祖先类群约在1.6亿年前由Mycenoid和Marasmioid这2个分支演化形成，这部分解释了FBP的种间同源性[33-34]。对N. nambi的基因组测序显示，NnHispS、NnH3H和NnLuz三者共同构成了高度保守的基因簇，部分小菇属和奥氏菇属物种的基因簇中具有细胞色素P450家族或富马乙酰乙酸水解酶家族的基因。进一步研究表明，Luz荧光素酶的演化起源于Agaricales基部类群的基因复制事件，其后数百万年间相继发生H3H和HispS的基因复制[32]。Kotlobay等[32]还认为HispS酮还原酶和脱水酶结构域的缺失，可能是真菌最终实现发光功能的关键节点。在酶学机理方面，刘亚军团队对FBP的有机化学机制进行了理论分析，为深入理解FBP各步骤的功能提供理论支撑[35-36]。
1.2 FBP自发光植物的创制 与其他BL系统相比，FBP在植物发光领域展现出4大核心优势：(1) 发光无需外源底物，前体物质CA是木质素代谢中间产物，在植物细胞中天然丰度高[37]；(2) 光谱特性适配，FBP荧光发射峰约520 nm，不易被植物色素吸收；(3) 检测方便快捷、灵敏度高，自发荧光可用电荷耦合器件(charge coupled device, CCD)相机监测；(4) 生物安全性优异，FBP酶系及中间代谢产物对真核细胞的毒性低[38]。2020年，Mitiouchkina等[39]将NnHispS、NnH3H、NnLuz和NnCPH基因密码子优化后的蛋白编码序列(coding sequence, CDS)导入烟草，首次创制了FBP自发光烟草，其荧光强度达到1010 photons/(min·cm2)，且株型大小、激素水平和叶绿素含量等指标与野生型无显著差异，这表明FBP对烟草没有明显毒害作用。
1.3 FBP自发光植物的改良 Khakhar等[40]将FBP成功导入本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)后，进一步整合了来自构巢曲霉[Aspergillus nidulans (Eidam) G. Winter]的4′-磷酸泛酰乙胺基转移酶(AnNPGA)、来自荚膜红菌[Rhodobacter capsulatus (Molisch) Imhoff et al.]的酪氨酸解氨酶(RcTAL)及2个来自大肠杆菌[Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers]的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶(EcHpaB, EcHpaC)，显著提高了植物自发光的强度。具体而言，RcTAL能将l-酪氨酸转化为CA的前体物质——对香豆酸(p-coumaric acid)，EcHpaB和EcHpaC能协同催化4-羟基苯乙酸转化为CA。因此，上述酶提高了植物内源CA含量，进而增强了发光效果。FBP与植物咖啡酸代谢途径的整合如图 4所示。2023年，都浩团队在FBP的基础上，额外导入了AnNPGA基因和来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的BnC3′H1基因，创制了增强版发光烟草eFBP，该烟草的发光强度达到了3×1011 photons/(min∙cm2)[6]。BnC3′H1能催化对香豆酰莽草酸(p-coumaoyl shikimate)转化为咖啡酰莽草酸(caffeoyl shikimate)，后者在咖啡酰莽草酸酯酶(caffeoyl-shikimate esterase, CSE)或羟基肉桂酰基转移酶(hydroxycinnamoyl transferase, HCT)的作用下，分别生成CA或咖啡酰CoA (caffeoyl CoA)，从而进一步提高植物体内FBP前体底物的含量。此外，该研究还证实AnNPGA能够显著增强NnHispS的聚酮酶活性，使hispidin的合成速率提升了3倍[1]。后续研究中，都浩团队利用机器学习算法预测出4CL、COMT、CHS、CCoAOMT和MYB11等5个木质素生物合成的关键基因，并通过人工微小RNA阵列(amiR array)进行靶向沉默[41]；将上述5个抑制苯丙烷类代谢基因的amiR array，与FBP核心基因、来自粘红酵母[Rhodotorula glutinis (Fresenius) Harrison]的酪氨酸解氨酶基因RgTAL、4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶基因HpaB和HpaC共同导入烟草，成功获得发光强度比eFBP提升8倍的eFBP2烟草植株。该研究通过amiR array进行跨物种基因沉默，有效减少了CA向木质素代谢旁路的流通，同时通过增强酪氨酸生物合成来提高CA含量，从而提升植物自发光的能力[41]。
图 4 FBP与植物咖啡酸代谢网络的整合[41]
Fig. 4 Integration of the FBP into engineered caffeic acid and hispidin metabolic network in plants[41]. Black solid arrows indicate a direct reaction, while grey dashed arrows represent multiple steps. Enzymes from microbes are highlighted in orange font, while compounds increased in the engineered network are in red font. The green down arrows indicate silencing by amiRNAs. PAL: Phenylalanine ammonia lyase; C4H: Cinnamic acid 4-hydroxylase; 4CL: 4-hydroxycinnamate: CoA ligase; TAL: Tyrosine ammonia lyase from Rhodotorula qlutinis; HpaB: 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase; HpaC: 4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase: reductase component; C3H: Coumarate 3-hydroxylase; CAD: Cinnamyl alcohol dehydrogenase; CCoAOMT: Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase; CCR: Cinnamoyl-CoA reductase; CHI: Chalcone isomerase; CHS: Chalcone synthase; COMT: Caffeate/5-hydroxyferulate 3-O-methyltransferase; DFR: Fihydroflavonol 4-reductase; F3H: Flavanone 3-hydroxylase; F3′H: Flavonoid 3′-hydroxylase; F5H: Ferulate 5-hydroxylase; FLS: Flavonol synthase; HCT: 4-hydroxycinnamoyl CoA: Shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase; C3′H: 4-coumaroyl shikimate/quinate 3′-hydroxylase; CSE: Caffeoyl shikimate esterase; Hisps: Hispidin synthase; NPGA: 4-phosphopantetheinyl transferase; H3H: Hispidin-3-hydroxylase; Luz: Luciferase; CPH: Caffeoylpyruvate hydrolase; ATP: Adenosine triphosphate; Mal-CoA: Malonyl CoA; CoA: Co-enzyme A; NAD(P)H: Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate).
黑色实线箭头代表直接反应，灰色虚线箭头代表多步反应。来自微生物的酶用橙色字体标注，咖啡酸代谢网络中产量增加的化合物用红色字体标注。绿色向下箭头表示通过amiRNA技术进行基因沉默。PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸4-羟化酶；4CL：4-羟基肉桂酸酯: CoA连接酶；TAL：来自粘红酵母的酪氨酸解氨酶；HpaB：4-羟基苯乙酸酯3-单加氧酶；HpaC：4-羟基苯乙酸3-羟化酶，还原酶成分；C3H：香豆酸3-羟化酶；CAD：肉桂醇脱氢酶；CCoAOMT：咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶；CCR：肉桂酰辅酶A还原酶；CHI：查尔酮异构酶；CHS：查尔酮合酶；COMT：咖啡酸/5-羟基阿魏酸-3-O-甲基转移酶；DFR：二氢黄烷醇4-还原酶；F3H：黄烷酮3-羟化酶；F3′H：类黄酮3′-羟化酶；F5H：阿魏酸5-羟化酶；FLS：黄酮醇合酶；HCT：4-羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸盐/奎因酸羟基肉桂酰转移酶；C3′H：4-香豆酰莽草酸/奎宁酸3′-羟化酶；CSE：咖啡酰莽草酸酯酶；HispS：牛奶树碱合酶；NPGA：4-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；H3H：牛奶树碱3-羟化酶；Luz：荧光素酶；CPH：咖啡酰丙酮酸水解酶；ATP：三磷酸腺苷；Mal-CoA：丙二酰辅酶A；CoA：辅酶A；NAD(P)H：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)。 图选项
FBP自发光植物的开发需要利用Cre/Loxp系统和Gateway技术构建含有多个目的基因片段的堆叠大载体[42]，然而，NnHispS基因片段(5 034 bp)较大，在载体构建时容易丢失。此外，NnHispS属于Ⅰ型聚酮合酶，其翻译后需要磷酸泛酰巯基乙胺基团修饰[43-44]，因此在异源系统中常与AnNPGA共表达，这使得堆叠载体的转录单元数量至少增加到5个。为解决这一问题，Palkina等[45]从苔藓植物、木兰科、单子叶植物和双子叶植物等21种植物中筛选出结构紧凑、功能高效的Ⅲ型聚酮合酶PpASCL。尽管本氏烟草的发光实验表明，PpASCL的活性比传统的AnNPGA/NnHispS组合低1个数量级[45]，但这一发现在简化堆叠大载体的基础上，为混合生物发光途径提供了新的可能。
基于进化理论，自然界中的蛋白质是生物体在漫长进化历程中形成的，它们在特定环境和生理条件下表现出最优的适合度，但未必具有最佳的活性。因此，除了完善CA代谢路径外，对FBP核心酶进行定向进化也是实现自发光植物优化的重要策略。蛋白质定向进化是一种在分子水平模拟自然进化过程的技术，通过人为引入基因突变，筛选出性能更优或者具有新功能的突变酶。这项技术的本质是进化论在微观领域的应用，它通过人工手段加快了变异和选择的速率，从而在短时间内实现蛋白质的功能优化。2024年，Shakhova等[46]对荧光素酶NnLuz进行定向进化，发现NnLuz_v3 (T99P、T192S和A199P)具有更高的稳定性和可持续性，并且使大肠杆菌和HEK293T细胞的发光强度提升至原来的1.5倍；随后对NnLuz_v3进行随机诱变，发现由I3S、N4T、F11L和I63T这4个点突变构成的NnLuz_v4使大肠杆菌的发光强度提高了3倍。同时，该团队对NnH3H定向进化得到NnH3H_v2 (D37E、V181I、S323M、M385K)[46]。另外研究发现，来自柠檬色小菇(Mycena citricolor Berk. & Broome)的McitHispS在多个异源系统中表现出优于NnHispS的特征[46]。基于上述结果，研究者构建了2套系统：FBP2 (包含NnHispS、NnH3H_v2、NnLuz_v4、NnCPH、AnNPGA)和FBP3 (包含McitHispS、NnH3H_v2、NnLuz_v4、NnCPH、AnNPGA)。在烟草、本氏烟草、拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]、加杨(Populus canadensis Moench)、菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)和矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)等植物系统中，FBP2和FBP3均表现出显著增强的发光效果[46]。
2 自发光植物的应用进展
2.1 FBP自发光植物的应用 在植物科学领域，解析DNA-蛋白质的互作机制，对于理解植物生长发育、基因表达调控、细胞信号转导等基础生物学过程具有重要意义。2025年，都浩团队成功开发了基于FBP的DNA-蛋白质互作报告系统，它能在植物全生命周期中对植物进行实时活体检测；FBP报告系统以NnLuz为报告基因，以光量子数和NnLuz表达量来定量检测互作强度[47]。为了验证FBP报告系统的有效性，研究人员在烟草叶片、向日葵花瓣和矮牵牛叶片中成功评估了3组水稻转录因子(transcriptional factors, TFs)和启动子(OsDREB1C-pOsRBCS3、OsJAMYB-pOsAGO18、OsbZIP42-pOsPER1A)的结合特异性与亲和力[47]。
在环境保护领域，FBP自发光植物可以作为生物传感器来监测环境中的毒素和污染物，为生态毒理学研究提供一种快速、灵敏和可持续的检测方法[48]。当植物受到环境胁迫时，其发光强度、频率或模式可能会发生变化，因此通过检测这些变化可以评估环境中有害物质的存在和浓度，能够为早期预警和生态风险评估提供科学依据。
FBP自发光植物的用途如图 5所示，在基础设施和园艺领域，未来持续增强的FBP自发光植物可以美化城市夜景、装饰室内环境和打造梦幻乐园，为城市建设与旅游业发展注入新的活力。与传统电力照明相比，FBP自发光植物利用光合作用的能量实现夜间发光，可以减少能耗并缓解光污染，契合可持续发展理念，因此理论上自发光植物可以替代部分商业照明，为绿色城市建设提供创新型解决方案，FBP自发光烟草的不同时期如图 6所示。基于FBP系统，美国LightBio公司研发的发光牵牛花在经过美国农业部(United States Department of Agriculture, USDA)和动植物卫生检验局(Animal and Plant Health Inspection Service, APHIS)的严格审查后，于2023年9月成功获得了双重认证。2024年2月，LightBio正式在官方网站销售发光牵牛，广受市场欢迎，充分展现了发光植物有着广泛的市场需求。但是，目前该发光植物的亮度较低，需要进一步研发提高其发光亮度。此外，由于该类发光植物属于转基因植物，在大部分国家或地区如中国、欧盟、日本等受到严格的监管。由于发光植物需要接受严格的、多年的生物安全和生态安全实验及转基因植物监管，其在我国的产业化任重道远。
图 5 FBP自发光植物的用途
Fig. 5 Applications of autoluminescent plants engineered with FBP.
图选项
图 6 发光烟草不同时期展示
Fig. 6 Display of glowing tobacco at different periods. A: Flowering period of the luminescent tobacco eFBP; B: Photography of the eFBP after it is removed from the organism; C: Photography of luminous tobacco eFBP2 seedling stage; D: Display of glowing eFBP2 at flowering period.
A：发光烟草eFBP开花期；B：发光烟草eFBP离体后拍照；C：发光烟草eFBP2苗期拍照；D：发光烟草eFBP2开花期展示。 图选项
2.2 应用技术瓶颈与人工智能驱动的创新方向 当前，FBP自发光植物在实际应用过程中面临3大技术瓶颈：(1) 发光强度低且稳定性不足，能量转换效率亟待提高；(2) 发光光谱局限于绿色荧光，缺乏多样性；(3) 存在转基因溢散风险，可能影响邻近生态系统[49]。目前，荧光强度低是FBP自发光植物应用过程中最主要的限制因素。随着生物技术与人工智能(artificial intelligence, AI)的快速发展，FBP自发光植物展现出以下4个具有前瞻性的发展方向。
第一，基于大数据挖掘的代谢路径优化策略，实现关键底物的“开源节流”。该方向通过大数据技术收集海量植物生理数据，并利用人工智能发掘数据间的内在关联，预测植物中CA等中间产物的代谢路径及其对底物代谢和植物生长的影响。这种大数据驱动的策略能有效提高FBP自发光植物的改良效率，为增强发光强度提供理论支持。
第二，限速酶的定向进化，通过机器学习获得性能更加优异的聚酮合酶和荧光素酶。在FBP自发光植物体系中，聚酮合酶与荧光素酶是影响荧光强度的关键步骤，前者调控牛奶树碱的生物合成效率，而后者直接催化氧化发光反应。然而，由于植物细胞质与真菌原生环境存在一定差异(如pH、离子强度和次生代谢物等)，真菌来源的酶系难以在植物细胞中维持原有活性，这限制了植物自发光的进一步增强。针对此问题，蛋白质定向进化技术展现出独特优势，它通过构建突变文库并筛选功能改良变体，突破天然酶的进化局限。蛋白定向进化策略包括非理性设计和理性设计：非理性设计通过易错PCR (error prone PCR, epPCR)引入随机突变，其无需蛋白结构信息，适用于未知功能域的酶系优化；理性设计是基于对蛋白质结构和功能的深入理解来综合改良蛋白质，涉及三维结构解析、功能位点预测和自由能模拟计算等方式。近年来，基于机器学习的理性设计显著提高了蛋白定向进化的速率和效果。2025年，Jiang等[50]开发了基于蛋白质语言模型(protein language models, PLMs)的EVOLVEpro平台，利用少量实验数据使核酸酶的编辑效率提高了5倍、单克隆抗体的结合亲和力提高了40倍、T7 RNA聚合酶的保真度提高了100倍。浙江大学Zhang等[51]建立了PLMs驱动的自动进化平台，仅用10 d完成了4轮定向进化，构建了384个点突变体，将p-氰基苯丙氨酸-tRNA合成酶(p-cyanophenylalanine-tRNA synthetase, pCNF-RS)的催化活性提高了2.4倍。这说明机器学习指导的蛋白质定向进化有望在短时间内改善外源酶在植物细胞质中的活性。
第三，荧光素酶的从头设计(de novo design)，开发能够产生不同波长荧光的新型荧光素酶。目前，FBP荧光素酶的光谱局限于绿光，严重限制了其在多色成像、光遗传学等领域的应用。蛋白质从头设计技术通过解构天然酶催化机制并重构新型功能模块，为突破光谱限制提供了革命性路径。而深度学习和Alphafold3的问世则为酶的从头设计提供了前所未有的可能。2023年，David Baker团队开发了基于深度学习的家族级蛋白质幻觉算法(family-wide hallucination)，并利用该模型成功设计出具有更高底物选择性的人工荧光素酶LuxSit，该算法通过生成包含定制化催化三联体的拓扑结构骨架，设计出相应的氨基酸序列，从而创造出自然界中不存在的新型酶[52]。
第四，核酸元件的智能设计，从转录水平上提升基因表达强度。核酸元件是遗传系统中最基本的生物积块，在生物基因表达和生命活动中发挥着重要作用，如启动子、增强子、核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)、非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)等。除了优化外源基因的密码子、预测和挖掘现有的核酸元件，机器学习还可以读取植物内源各类核酸元件的稳定性和特异性，从而构建模型分析序列与功能之间的对应关系[53]，再通过实验将实际结果返还给AI，最终得到适合烟草的启动子、终止子和增强子的核酸元件组合，从而有效提高FBP途径相关基因的表达。
对于转基因溢散问题，可以敲除烟草中NtMS1等花粉育性基因或引入雄性不育基因，构建雄性不育系[49]。在大规模生产应用前，需要对转基因烟草进行全面的生态风险评估，以缓解基因漂移问题[49]。FBP自发光植物为植物科学、环境保护和园艺生产等领域带来了全新的机遇和挑战。随着相关技术的突破和优化，它有望在更多应用领域释放巨大潜能，为我们的生活添彩增色，为我们的世界绘景铺光。
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